Kit de detección del virus de la peste porcina africana

Kit de detección del virus de la peste porcina africana Instrucciones (Método de Columna de Membrana)

Se utilizó el kit de detección del virus de la peste porcina africana para detectar el ADN del virus de la peste porcina africana en muestras de sangre total, suero, bazo, ganglios linfáticos, músculo y heces de cerdos mediante PCR fluorescente.

[Nombre del producto] Nombre genérico: Kit de extracción de ADN viral

Nombre en inglés:Extraction Kit for Virus DNA

[Uso previsto] Este kit se utiliza principalmente para la extracción de ADN viral de sangre anticoagulada, suero, hisopos, tejidos, alimento y el medio ambiente en muestras sospechosas de infecciones virales y otros patógenos.El ácido nucleico purificado es adecuado para diversos procedimientos de rutina y ensayos de PCR.

[Componentes del kit]

I.Composición del kit y condiciones de almacenamiento: Nombre: 20T 50T

1.Columnas de adsorción: 20 columnas, 50 columnas
2.Tubos de recolección: 20 columnas, 50 columnas
3.Tampón de lisis: 5 mL, 11 mL
4.Tampón de lavado I: 13 mL, 32 mL
5.Tampón de lavado II: 13 mL, 32 mL
6.Eluyente: 1,2 mL, 3 mL

2.Condiciones de almacenamiento y vida útil: Conservar a temperatura ambiente.Vida útil: 12 meses.

3.Materiales necesarios: Etanol anhidro, tubos de centrífuga estériles de 1,5 mL, tubos de centrífuga estériles de 1,5 mL (brazo largo), solución salina fisiológica, mortero, puntas de pipeta estériles de 1 mL, 200 µL y 10 µL, marcador, etc.

[Procedimiento]

I.Preparación de la muestra

1.Muestra de sangre: Coloque las muestras de sangre anticoagulada en un tubo de centrífuga y centrifugue a 8000 rpm durante 2 minutos.Recoja la capa de plasma.Coloque las muestras de sangre no anticoagulada en un tubo de centrífuga.Tras la coagulación, centrifugue a 8000 rpm durante 2 minutos.Recoja la capa de suero y colóquela en un tubo de centrífuga estéril.Numere la muestra para el análisis.

2.Muestra de tejido: Recoja 0,1 g de muestras de tejido enfermo del bazo, hígado, ganglios linfáticos, amígdalas, etc.Homogeneice o triture bien en un homogeneizador de tejidos o mortero.Añada 1 ml de solución salina normal y mezcle bien.Centrifugue a 8000 rpm durante 2 minutos.Recoja el sobrenadante y colóquelo en un tubo de centrífuga estéril.Numere la muestra para la prueba.

3.Fluido Oral: Antes de alimentar, utilice una bolsa de recolección de fluido oral con hisopo o una gasa casera con hilo de algodón para inducir al animal a masticar.Recoja más de 500 µL de fluido oral.Centrifugue a 8000 rpm durante 2 minutos.Recoja el sobrenadante y colóquelo en un tubo de centrífuga estéril.Numere la muestra para la prueba.

4.Alimento: Tome una cantidad adecuada de alimento molido (aproximadamente 0,2 g) y colóquela en un tubo de PE de 2 ml que contenga 1 ml de solución salina o tampón PBS (pH 7,4).Mezcle bien con un vórtex.Centrifugue a 8000 rpm durante 2 minutos.Retire el sobrenadante y colóquelo en un tubo de centrífuga estéril.Numere el tubo para la prueba.5.Polvo: Utilice un hisopo de algodón estéril para recoger una cantidad adecuada de polvo de las superficies ambientales.Colóquelo en un tubo EP de 2 ml con 1 ml de solución salina o tampón PBS (pH 7,4).Agite bien en vórtex.Centrifugue a 8000 rpm durante 2 minutos.Retire el sobrenadante y colóquelo en un tubo de centrífuga estéril.Numere el tubo para la prueba.

II.Extracción de ADN

1.Tome 200 μL de lisado y añada 1,5 mL de un tubo de centrífuga sin nucleasas.Añada 200 μL de cada solución de muestra (plasma, suero o fluido tisular).Agite bien en vórtex durante 10 segundos o invierta 10 veces.Incube a temperatura ambiente durante 5 minutos (si la temperatura ambiente es inferior, incube en un baño de agua a 25 °C).A continuación, añada 200 μL de etanol anhidro e invierta durante 10 segundos.Si la muestra está turbia, centrifugue a 12 000 rpm durante 1 minuto y recoja el sobrenadante para evitar la obstrucción de la columna.

2.Transfiera la muestra a una columna de adsorción equipada con un tubo colector y centrifugue a 12 000 rpm durante 1 minuto.

3.Deseche el líquido del tubo colector, añada 600 µL de Solución de Lavado I a la columna de adsorción y centrifugue a 12 000 rpm durante 1 minuto.

4.Deseche el líquido del tubo colector, añada 600 µL de Solución de Lavado II a la columna de adsorción y centrifugue a 12 000 rpm durante 1 minuto.

5.Deseche el líquido del tubo colector y centrifugue a 12 000 rpm durante 2 minutos para eliminar completamente cualquier residuo de solución de lavado.

6.Transfiera la columna de adsorción a un tubo EP nuevo de 1,5 ml (de brazo largo) sin ácidos nucleicos.Añada 50 µL de solución de elución al centro de la columna, deje reposar 1 minuto y centrifugue a 12 000 rpm durante 1 minuto.El líquido del tubo EP es ADN viral.

[Notas] 1.Antes del experimento, lea atentamente las instrucciones de este kit y siga estrictamente los pasos.Un control preciso del tiempo, los volúmenes de reactivo y otros parámetros durante la operación proporcionará los mejores resultados.

2.Las muestras deben recolectarse frescas o almacenarse y transportarse a bajas temperaturas.

3.Las muestras conllevan un riesgo potencial de infección; la extracción de ácidos nucleicos debe realizarse en una cabina de bioseguridad en el laboratorio de extracción de ácidos nucleicos.

4.Asegúrese de que todos los consumibles para la extracción de ácidos nucleicos estén esterilizados a altas temperaturas.Después de la extracción, los ácidos nucleicos deben utilizarse para el siguiente paso de la prueba o congelarse para su uso posterior lo antes posible.

5.Mezcle bien los reactivos antes de usarlos.Los reactivos son algo corrosivos, por lo que se recomienda usar guantes y mascarilla para una protección adecuada al manipularlos.

6.La cristalización del lisado a bajas temperaturas es normal.Puede disolverse calentándolo en un baño de agua a 60 °C antes de su uso.

7.Los residuos generados durante el experimento deben recogerse rápidamente y eliminarse de forma segura, lejos del laboratorio de PCR.

Solo para uso diagnóstico veterinario.

Instrucciones para el kit de detección de ácidos nucleicos por PCR fluorescente del virus de la peste porcina africana [Nombre del medicamento veterinario]

Nombre genérico: Kit de detección de ácidos nucleicos por PCR fluorescente del virus de la peste porcina africana

Pinyin chino:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

nombre en inglés：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

Nombre del producto: Ninguno

[Ingredientes principales y contenido] El kit contiene los siguientes componentes: contenido del kit, control positivo 250 μL/tubo × 1 tubo, control negativo 250 μL/tubo × 1 tubo, solución de reacción PCR 850 μL/tubo × 1 tubo, solución mezclada 150 μL/tubo × 1 tubo, manual de instrucciones (1 copia/caja)

[Función y uso] Este kit puede utilizarse para detectar el ácido nucleico del virus de la peste porcina africana en sangre, bazo, hígado, ganglios linfáticos, amígdalas, riñones, músculos, muestras ambientales, etc.

[Uso y criterio]

1 Uso

1.1 Recolección, almacenamiento y transporte de las muestras a analizar

1.1.1 Recolección de muestras

(1) Muestras de cerdos vivos: Recolectar asépticamente 5 ml de sangre o suero anticoagulado

(2) Muestras de autopsia de cerdos muertos o muestras de autopsia de mataderos, asépticamente Recolectar muestras de tejido como amígdalas, pulmones, riñones, ganglios linfáticos, músculos, etc., de cerdos muertos.Transportarlas al laboratorio a una temperatura baja de 2 a 8 °C para su análisis.

(3) Entorno circundante contaminado por cerdos enfermos.Recolectar muestras de heces, alimento y aguas residuales de lugares relacionados con cerdos enfermos.Transportarlas al laboratorio a una temperatura baja de 2 a 8 °C para su análisis.

1.1.2 Almacenamiento de las muestras

Las muestras recolectadas deben almacenarse a una temperatura de 2 a 8 °C durante un máximo de 24 horas y a -70 °C para evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.

1.1.3 Transporte de las muestras

La caja de espuma debe sellarse con bolsas de hielo para su transporte.El embalaje y el transporte deben cumplir con las "Especificaciones de embalaje para el transporte de muestras de microorganismos patógenos animales altamente patógenos (virus)" del Ministerio de Agricultura y Asuntos Rurales y las regulaciones pertinentes del departamento de transporte sobre la gestión del transporte de mercancías peligrosas.

1.2 Procesamiento de la muestra

1.2.1 Procesamiento de la muestra de sangre

La muestra de sangre anticoagulada se coloca en un tubo de centrífuga y se centrifuga a 8000 rpm durante 2 minutos para extraer la capa superior de plasma y numerarla para su análisis.La muestra de sangre no anticoagulada se coloca en un tubo de centrífuga y, tras la coagulación, se centrifuga a 8000 rpm durante 2 minutos para extraer 200 μL de la capa superior de suero y numerarla para su análisis.

1.2.2 Procesamiento de la muestra de tejido

Tome una cantidad adecuada de bazo, hígado, ganglios linfáticos, amígdalas, músculo u otros tejidos y tritúrelos en un triturador o tubo de trituración.Añada una cantidad adecuada de solución salina fisiológica y mezcle bien hasta obtener un homogeneizado al 10 %.Centrifugue a 8000 rpm durante 2 minutos.Transferir 200 μL del sobrenadante a un tubo de centrífuga estéril sin ARNasa ni ADNasa y numerarlo para su posterior uso.

1.2.3 Procesamiento de Muestras Ambientales

1.2.3.1 Procesamiento de Muestras Fecales y de Alimento

Tomar una cantidad adecuada de heces o alimento y triturarlas en un tubo de trituración con tampón PBS para obtener un homogeneizado al 10%.Centrifugar a 8000 rpm durante 2 minutos.Transferir 200 μL del sobrenadante a un tubo de centrífuga estéril sin ARNasa ni ADNasa y numerarlo para su posterior uso.

1.2.3.2 Procesamiento de Muestras de Aguas Residuales

Extraer directamente 200 μL de aguas residuales para la extracción de ácidos nucleicos.

1.3 Extracción de Ácidos Nucleicos Virales: La extracción de ácidos nucleicos de ADN se realiza mediante un método de perlas magnéticas o columna.

1.4 Reacción de PCR de fluorescencia:

1.4.1 Retire la solución de reacción de PCR de fluorescencia y la mezcla enzimática del kit, descongélelas a temperatura ambiente y centrifugue a 2000 rpm durante 5 segundos.Suponiendo que el número total de muestras de prueba, controles positivos y negativos es n, el sistema de reacción se prepara de la siguiente manera:

Sistema de reactivos

Solución de reacción de PCR: 17 × (n + 1) μL

Mezcla enzimática: 3 × (n + 1) μL

1.4.2 Añada los reactivos anteriores a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mL con ARNasa/ADNasa, mezcle bien y centrifugue brevemente.Divida los reactivos en alícuotas de 20 μL/tubo en tubos de reacción de PCR de fluorescencia.

1.4.3 Añadir 5 μL de cada control negativo y positivo, y 5 μL de cada ácido nucleico de prueba procesado a los tubos de reacción de PCR de fluorescencia preparados, hasta un volumen final de 25 μL/tubo.Tapar los tubos de reacción de PCR de fluorescencia, mezclar bien, centrifugar brevemente y transferir al instrumento de PCR de fluorescencia.

Colocar el tubo de reacción de PCR en el pocillo de muestra de un instrumento de PCR de fluorescencia y ejecutar el siguiente programa en el instrumento:

Paso Condiciones Ciclos Tratamiento UNG 50 °C, 2 minutos 1 Predesnaturalización 95 °C, 3 minutos 1 Preamplificación 95 °C: 8 segundos 55 °C: 8 segundos 5 Amplificación por PCR 95 °C: 8 segundos 55 °C: 8 segundos 40

Seleccionar FAM como canal de fluorescencia y recolectar las señales de fluorescencia a 55 °C durante cada ciclo de la fase de amplificación por PCR.Ajuste el volumen de amplificación a 25 μL y seleccione los modos de referencia pasiva y de extinción como ninguno.(Nota: Si un instrumento de PCR de fluorescencia (como el AB17500) no funciona debido a un tiempo de espera corto tras configurar el programa de reacción según las instrucciones, las condiciones de preamplificación y PCR pueden modificarse a 95 °C durante 5 segundos y 55 °C durante 30 segundos).

2 Evaluación de resultados

2.1 Evaluación de la validez de la prueba

Si el control positivo presenta una curva de amplificación típica con un valor Ct ≤ 30 y el control negativo no presenta ningún valor Ct o curva de amplificación, la línea es recta o ligeramente inclinada, y no presenta fase de crecimiento exponencial, el resultado de la prueba se considera válido.De lo contrario, la prueba se considera inválida.

2.2 Evaluación de la muestra

2.2.1 Positivo: Un resultado de la prueba de muestra con un valor Ct ≤ 35 y una fase de crecimiento exponencial clara indica la presencia de ácido nucleico del virus de la peste porcina africana.2.2.2 Sospechoso: Resultado de la prueba de muestra con un valor Ct entre 35 y 38.En este caso, se debe repetir la muestra.Si el valor Ct del experimento repetido se mantiene entre 35 y 38 y se observa una clara fase de crecimiento exponencial, se considera positivo; de lo contrario, negativo.

2.2.3 Negativo: Si el valor Ct de la prueba de muestra es superior a 38 o no se detecta ningún valor Ct, se determina que no se detectó ácido nucleico del virus de la peste porcina africana.

【Notas】（1）Lea atentamente las instrucciones de este kit antes del experimento y siga estrictamente los pasos de operación.Un control preciso del tiempo, el volumen de reactivo, etc.durante la operación permite obtener los mejores resultados.

（2）El laboratorio debe estar estrictamente dividido en zonas según la normativa vigente y las pruebas genéticas deben realizarse en el siguiente orden: área de preparación de líquidos, área de extracción de plantilla, área de amplificación y área de análisis.Se deben imponer requisitos estrictos para el personal, el equipo, los reactivos y el flujo de aire en cada zona.

(3) Los consumibles relacionados con la extracción de ácidos nucleicos deben asegurarse de que estén limpios y libres de DNasa/RNasa.El proceso de extracción debe realizarse a la menor temperatura y con la mayor rapidez posible.Una vez finalizado, proceda al siguiente experimento o congélelo.

(4) Para los instrumentos con iluminación superior, utilice guantes de PE desechables nuevos para sellar los tubos de PCR fluorescentes.Para los instrumentos con iluminación inferior, evite tocar el fondo de los tubos de PCR fluorescentes con las manos descubiertas o con guantes usados.Utilice guantes de látex desechables sin sustancias fluorescentes durante la prueba.

(5) Los reactivos congelados deben descongelarse completamente a temperatura ambiente antes de su uso y centrifugarse brevemente para permitir que el líquido se asiente completamente en el fondo del tubo.Evite congelar y descongelar repetidamente para no afectar el rendimiento de los reactivos.

(6) Las muestras, controles positivos, etc., deben sellarse inmediatamente después de su uso para evitar la contaminación entre los componentes y aerosoles, que podrían causar falsos positivos.

(7) Los productos de amplificación no deben abrirse.Los residuos generados por el experimento deben recogerse de forma oportuna y eliminarse de forma segura, lejos del laboratorio de PCR.

[Especificación] 50 dosis/caja

[Conservación y fecha de caducidad] El kit debe almacenarse a menos de -20 °C, protegido de la luz.La fecha de caducidad es de 12 meses.

[Número de autorización] Código de medicamento veterinario: 163668871

Solo para diagnóstico veterinario