Kit para la determinación del sexo en palomas

Kit para la determinación del sexo en palomas (Método de PCR con sonda fluorescente y referencia interna)

Kit para la determinación del sexo en palomas se utiliza ampliamente para la identificación del sexo de diferentes aves, la amplificación por PCR tiene un buen efecto y puede determinar con precisión el sexo de las aves.

Este kit amplifica y detecta el gen CHD-W conservado en muestras como plumas, sangre y tejidos de paloma, lo que permite identificar el sexo de las palomas. La introducción de una referencia interna permite monitorizar el proceso de extracción y amplificación de ácidos nucleicos, garantizando así la precisión de los resultados de la prueba.

Kit para la determinación del sexo en palomas Contenido del producto:

Kit para la determinación del sexo en palomas Condiciones de almacenamiento:

Conservar a -20 °C. Vida útil: al menos 12 meses.

Kit para la determinación del sexo en palomas Procedimiento experimental:

1. Preparación de la muestra (Zona de preparación de muestras)

1.1 Requisitos de la muestra:

Plumas: Recolectar al menos cinco plumas (incluyendo las cañas) del pecho, abdomen o patas. No utilizar plumas mudadas naturalmente.

Sangre entera: Usar EDTA como anticoagulante; no usar heparina. Usar sangre entera fresca y conservar a 2-8 °C durante un máximo de 7 días o a -20 °C durante un máximo de 3 meses. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.

Tejido: Recolectar hasta 100 mg de tejido muscular u orgánico fresco (evitar muestras difíciles de manipular, como piel o fascia, si es posible). Preparar un homogeneizado de tejido en 200-500 μL de agua estéril para la posterior preparación de la muestra.

1.2 Preparación de la muestra:

Consulte las instrucciones del "Kit de extracción rápida de ADN genómico animal (para análisis por PCR)" (n.° de cat. DP202) de Sanshi Biotechnology, u otros kits o métodos de extracción de ácidos nucleicos que cumplan los requisitos pertinentes, para extraer el ácido nucleico de la muestra procesada. Coloque la muestra de ácido nucleico extraída en una nevera portátil y analícela lo antes posible. Consérvela a 4 °C durante un máximo de 7 días o a -20 °C durante un máximo de 6 meses.

2. Prepare el sistema de reacción (zona de adición de muestras)

2.1 Retire todos los componentes del kit y descongélelos completamente a temperatura ambiente. Centrifugue durante 10 segundos para eliminar el líquido de las paredes y las tapas del tubo y depositarlo en el fondo. Prepare el sistema de reacción según el número de muestras (n + 2) (es decir, n muestras a analizar + 1 control positivo + 1 control negativo). El método de preparación específico es el siguiente: pipetear ((n + 2) × 11,5 µL de solución de reacción de GW + (n + 2) × 11,5 µL de premezcla de GW) en un tubo de centrífuga limpio. Mezclar bien mediante pipeteo. Repartir en tubos de PCR, 23 µL por pocillo, y conservar en una nevera portátil hasta su uso.

2.2 A continuación, añadir 2 µL del control negativo, el ácido nucleico de la muestra extraído y el control positivo de GW a la solución de reacción, en ese orden. Tapar los tubos y registrar la reacción. El volumen total de cada reacción es de 25 µL. Mezclar bien, centrifugar durante 10 segundos y realizar la amplificación en un equipo de PCR.

3. Amplificación por PCR (Área de Amplificación y Análisis de Producto)

Predesnaturalización a 95 °C durante 3 minutos; Desnaturalización a 95 °C durante 10 segundos, hibridación y extensión a 58 °C durante 30 segundos, durante 35 ciclos. La señal de fluorescencia se recoge a 58 °C. Seleccione FAM (gen CHD-W) como primer canal de fluorescencia y VIC/HEX (gen de referencia endógeno) como segundo canal de fluorescencia. (Utilice un instrumento de PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real de la serie ABI. Si es necesario, contacte con el fabricante con antelación o añada el colorante de calibración ROX usted mismo; de lo contrario, siga el procedimiento habitual).

4. Interpretación de los resultados

4.1 Si los valores de Ct de los canales FAM y VIC/HEX del control positivo son <28 y presenta una curva de amplificación en forma de S, y el control negativo no presenta ningún valor de Ct o un valor de Ct ≥35 y no presenta una curva de amplificación en forma de S, el resultado es válido. De lo contrario, repita el experimento. Si la nueva prueba sigue sin funcionar, contacte con el personal técnico del fabricante.

4.2 El valor de Ct del canal VIC/HEX de la muestra debe ser ≤30 y presentar una curva de amplificación en forma de S, lo que indica una extracción y amplificación eficaces. Si no hay valor de Ct en el canal VIC/HEX o si el valor de Ct es 30 < Ct ≤ 35, esto indica una extracción deficiente de ácidos nucleicos o la presencia de interferencias inhibitorias fuertes (como desinfectantes residuales como alcohol o anticoagulantes) que inhiben la amplificación. Se recomienda reprocesar la muestra para la extracción y amplificación de ácidos nucleicos.

4.3 Tras un resultado positivo en la prueba del canal VIC/HEX de la muestra, proceda a la evaluación del canal FAM:

Si el valor de Ct es ≤30 y presenta una curva de amplificación en forma de S, se evalúa la muestra. Un resultado positivo para el gen CHD-W indica que la muestra es de origen femenino.

Un valor de Ct de 30 < Ct < 32 se considera sospechoso y se recomienda repetir la prueba (se recomienda descartar primero falsos positivos causados por contaminación ambiental por aerosoles antes de volver a extraer y analizar el ácido nucleico). Si el valor de Ct del canal FAM es < 30 tras eliminar la contaminación por aerosoles y se observa una curva de amplificación clara, la muestra se considera positiva para el gen CHD-W; de lo contrario, se considera negativa.

La ausencia de un valor de Ct o un valor de Ct ≥ 32 sin una curva de amplificación en forma de S indica que la muestra es negativa para el gen CHD-W, lo que indica que podría ser de origen masculino.

Kit para la determinación del sexo en palomas Notas:

1) Para evitar la contaminación, el experimento debe realizarse en áreas estrictamente compartimentadas. Idealmente, la separación física entre compartimentos es esencial para evitar la contaminación cruzada causada por factores humanos. Use ropa de trabajo y guantes de látex durante el experimento. Use las herramientas en áreas separadas y cámbiese los guantes y batas según sea necesario. Después de la PCR, no abra la tapa inmediatamente. Deje que la muestra se enfríe lo suficiente antes de abrirla para minimizar la contaminación por aerosoles.

2) Los reactivos deben descongelarse completamente antes de su uso, pero se deben evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Siga estrictamente las instrucciones de preparación de reactivos y adición de muestras. Las mesas de operaciones, centrífugas, pipetas y demás instrumental deben desinfectarse regularmente con desinfectantes que contengan cloro, alcohol desinfectante, eliminadores de contaminación por ácidos nucleicos o luz ultravioleta.

3) Un resultado negativo no indica necesariamente sexo masculino. La imposibilidad de extraer (o detectar) ácido nucleico debido a mutaciones desconocidas en la muestra, calidad deficiente, baja carga o la presencia de inhibidores de interferencia potentes también puede resultar en un resultado "negativo". Este kit está diseñado únicamente para la amplificación específica del gen CHD-W en palomas. Para obtener más información sobre otros productos, póngase en contacto con el fabricante.

4) Este producto es de un solo uso. Los componentes del reactivo son sensibles a la luz natural. Protéjalo de la luz durante el envasado y el almacenamiento. No lo congele ni lo descongele repetidamente. Este producto es solo para investigación científica y no está destinado a su uso en diagnóstico clínico ni con otros fines.